荧光抗体染色方法-补体法

补体法

1．材料

（1）免疫血清 60℃ 灭活 20 min，用 Kolmers 盐水作 2 倍稀释成 1：2，1：4，1：8……。补体用 1：10 稀释的新鲜豚鼠血清，抗补体荧光抗体等，按下述的补体法染色。免疫血清补体结合的效价，如为 1：32 则免疫血清应作 1：8 稀释。

（2）补体用新鲜豚鼠血清一般作 1：10 稀释或按补体结合反应试管法所测定的结果，按 2 单位的比例，用 Kolmers 盐水稀释备用。Kolmers 盐水配法：即在 pH7.4、0.1mol/L 的磷酸缓冲盐水中，溶解 MgSO4 的含量为 0.01% 浓度。

（3）抗补体荧光抗体：在免疫血清效价为 1：4，补体为 2 单位的条件下，用补体染色法测定免疫豚鼠球蛋白荧光抗体的染色效价，然后按染色效价 1：4 的浓度用 Kolmers 盐水稀释备用。

2．方法步骤

（1）涂片或切片固定。

（2）吸取经适当稀释之免疫血清及补体之等量混合液（此时免疫血清及补体又都稀释一倍）滴于切片上，37℃ 作用 30 min，置于保持一定湿度的染色盒内。

（3）用缓冲盐水洗 2 次，搅拌，每次 5 min，吸干标本周围水液。

（4）滴加经过适当稀释之抗补体荧光抗体 30 min，37℃，水洗同（3）。

（5）蒸馏水洗 1 min，缓冲甘油封固。

3．对照染色

（1）抗原对照。

（2）抗血清对照：用正常兔血清代替免疫血清。

（3）灭活补体对照：将补体经 56℃30 min 处理后，按补体同样比例稀释，与免疫血清等量混合后，进行补体法染色。

本法之荧光抗体不受免疫血清的动物种属的限制，因而一种荧光抗体可作更广泛的应用，敏感性亦较间接法高，效价低的免疫血清亦可应用，节　省免疫血清，尤其是对检查形态小的如立克氏体、病毒颗粒等或浓度较低的抗原物质时甚为理想。