大鼠血浆中的人参皂甙Rb1，Rb2 和Rb3：在药代动力学研究中的应用

通过快速敏感的液相色谱-质谱法串联测定大鼠血浆中的人参皂甙Rb1，Rb2 和Rb3：在药代动力学研究中的应用

摘要

为了确定分别口服给药（

50

毫克

/

千克）和静脉给药（

10

毫克

/

公斤）的

RB1

，

RB2

，和

R b3

后的大鼠体内人参皂苷

RB1

，

RB2

，

和

R b3

的药代动力学，

开发了一种灵敏快速液相色谱

- 

串联质谱法。血浆样品用皂苷

Rg2

为内标的饱和的正丁醇进行萃取。色谱分离，

Zorbax 

SB-C18

柱

（

50

毫米×

4.6

毫米，

1.8

≤

M

）

；

流动相，

甲醇

-1 mM

甲酸铵

（

74:26 

，

V / V

）

。

使用

RB1

，

RB2

和

RB3

分别为

M / Z 1107.7

→

M / Z = 178.9 

，

M / Z 1077.7 

→

M / Z 148.6 

，

与

m/z1077.7 

→

M / Z 783.4

的碎片转换进行多反应监测模式。校正曲线在

20-1000

纳克

/

毫

升的

RB1

和

R B2 

，

和

50-2500

纳克

/

毫升为

Rb3

的浓度范围回收。

检出限分别为

3.0 ng / ml

和

4.0

纳克

/

毫升和

6.5

纳克

/

毫升。

3

种人参皂甙的日内及日间变异均小于

15 

％

，准确度

在

86-114 

％。所有

3

种人参皂苷具有差的口服生物利用度（

RB1

，

RB2

，和

R b3

分别为

0.78

％

，

0.08

％

，

和

0.52

％）

。

皂苷

Rb1

的值比甙

Rb2 

或

Rb3

的更高，

表明通过口服给药，

带有己糖和羟基的人参皂甙（

RB1

）可以比那些在相同的糖基化位点带有戊糖基团的呈现

更好的药代动力学行为。

1.

说明

人参皂甙已被视为三七药材的药理作用的主要活性成分

[1]

。三七提取物中，人参皂甙

Rb1

是主要皂甙，甙

Rb2

和

Rb3

是其他小的成分。这三种人参皂甙均为

20

（

S

）

- 

原人参

二醇皂苷（

PPD

）

，并具有相同的糖基化位点（

C-3

位点，

C-20

位点）

。区别仅在于连接到

C-20

位点的糖苷。皂苷

Rb1

连接有两个葡萄糖，

RB2

连接有一个葡萄糖和一个

α

-L-

吡喃阿

拉伯糖基，和

R b3

连接有一个葡萄糖和一个

β

-D-

木糖（图

1

）

。

到现在为止，

人参皂苷的药代动力学特性已经出版了许多文献。

刘等人。

发现，

RB1

，

RB2

，

Rc

和

Rd

静脉给药后均迅速在大鼠脑，肌肉和神经组织分布

[2]

。

Song

等。报道

R1

，人参

皂苷

Rg1

和

Rb1

经犬口服后的药代动力学研究。结果表明，皂苷

Rb1

的

Cmax

为

28.6

纳克

/

毫升

[3]

。

Chen

等人，报道称，

皂甙

Rb1

的

T1 / 2

比

Rg1

和

R1

的更长

[4]

。

皂苷

Rb1

的生物

利用度一直

报道为

4.35

％

[5]

。在

Ra3

，皂苷

Rb1

，

Rd

，

Re

，皂苷

Rg1, R1

的吸收和分布的

研究中，表明，大多数人参皂甙是受到广泛迅速胆汁排泄，导致他们的短

T1 /2

值

[6]

。

虽然皂苷

Rb1

的药代动力学特性已知，

RB2

和

Rb3

的信息是罕见的。实际上，关于甙

Rb2

和

Rb3

的药代动力学行为的有限的信息已经发布。因此，

RB2

和

Rb3

的药代动力学的研究

是必要的，

有助于澄清药代动力学和人参皂甙结构偏好之间的关系。

由于人参皂甙在吸

收

203 nm

处有较差的紫外辐射

[5]

。

的液相色谱

- 

质谱

（

LC-MS

）

[7-9]

和液相色谱

- 

串联

质谱（

LC-MS/MS

）

[10-12]

的方法被广泛用于分析人参皂甙。

在这项研究中，我们开发了一个简单，快速，灵敏的

LC-MS/MS

方法来确定口服和静脉三

个人参皂苷给药后，

RB1

，

RB2

，和

R b3

的血浆浓度，并进行系统的比较三种人参皂甙药

代动力学行为的相似性和差异。

2.

材料和方法

2.1

化学药品及试剂

人参皂苷

Rb1

，

Rb2

、

Rb3

，和

Rg2

，

（内标，

IS

）

（

99%

）是从化学学院，吉林大学（长春，

中国）

。从安捷伦科技得到了甲酸铵。其他试剂是

HPLC

级。

2.2

仪器和分析条件

将

Agilent 1200

快速分离

HPLC

系统与配有电喷雾电离

（

ESI

）

的安捷伦

6410

三重四极杆质

谱仪串联。该柱是

Agilent ZORBAX SB-C 18

柱（

50

毫米×

4.6

毫米，

1.8

≤

M

）

。流动相：甲

醇和

1 mM

甲酸铵（

74:26

，体积

/

体积，

pH

值

6.0

）

，流速为

0.4

毫升

/

分钟。对

RB1

，

RB2

，

RB3

和

IS

分别

M 

/ 

Z1107.7

→

M 

/ 

Z 

=178.9

，

M 

/ 

Z1077.7

→

M 

/ 

Z 

=148.6

，

M 

/ 

Z1077.7

→

m/z783.4

，和

m / z783.6

→

M / Z475.1

的负多反应监测来进行定量。

RB1

，

RB2

，和

R b3

的

裂解

/

碰撞能量的值分别在

250 V/55 V

，

210 V/67 V

，

200 V/58 V

。

流速，

9

升

/

分钟

;

雾化压力，

40

磅；气体温度，

350◦C

。

2.3

校准曲线和血浆样品的制备

标准曲线的制备用原液对空白大鼠血浆加标至浓度：

Rb1

和

Rb2

为

20

，

50

，

100

，

500,1000

纳克

/

毫升，

RB3

为

50

，

100

，

500

，

1000

，和

2500

纳克

/

毫升复用。样品（

100

微升）与

IS

溶液（

1

微克

/

毫升，

10

微升）混合，用

900

微升饱和的正丁醇萃取。以

13,000

×

g

的离心

10

分钟后，将上清液在氮气流中蒸发浓缩至干。将残余物溶解在

100

微升流动相中，并离

心

10

分钟。取

20

微升的上清液注入到

LC-MS/MS

。

2.4

方法学验证

基体效应是通过浓缩到标准溶液的当量浓度后的物标的响应的比较来评估。

QC

样品制备为

三种浓度：

Rb1

、

Rb2

为

50

，

100

，和

1000ng/

毫升；

Rb3

为

100

，

500

，

2500ng/

毫升。在大

鼠血浆中的

QC

样品（

N 

= 

5

）日内和日间的检测在三个独立的天评估。通过将在相同的浓

度的

QC

（

n = 5

）样品中的分析物，与后提取的空白大鼠血浆中被加标后的分析物的响应的

比较，确定了萃取回收率。

QC

样品（

N = 3

）被测定，在长凳上室温下放

8

小时，做冻融–

处理重复三次，处理后样品的稳定性。

2.5

在大鼠体内的药代动力学研究

SD

大鼠（

200

–

220 

g

）由广东省实验动物中心提供（广州，中国）

。所有的研究是由南方医

科大学伦理委员会批准。大鼠随机分为六组：三组分别经尾静脉静脉注射（

10

毫克

/

公斤）

Rb1

，

Rb2

、

Rb3

，另外三组分别口服人参皂苷

Rb1

，

Rb2

、

Rb3

（

50

毫克

/

公斤）

。血液样品

在

0.083

，

0.25

，

0.5

，

1

，

2

，

4

，

6

，

8

，

12

，

24

和

36 h

收集（

IV

）

，和

0.25

，

0.5

，

0.75

，

1

，

1.5

，

2

，

3

，

4

，

6

，

8

，

10

，

12

，

24

，

和

36 h

（

PO

）

。

血液样品应立即离心，

直到分析前在

−20◦C

存储。

3.

结果和讨论

3.1

方法学验证

在

Rb1

、

Rb2 20

–

1000ng/

毫升和

Rb 350

–

2500ng/

毫升的浓度范围内校准曲线为线性。检测

限（

LOD

）为

3ng/

毫升，

4ng/

毫升，和

6.5ng/

毫升

基体效应的结果是在

90

–

112%

（

n 

= 

5

）范围。日内和日间的准确度在

86

–

114%

，精密度

均在可接受的范围内，在三种浓度（

n = 5

）下。提取回收率在

52

–

117%

。在稳定性评估时

所有样品显示小于

15%

（

RSD

）的变异。

3.2

药代动力学研究中的应用

该方法已成功地应用于

Rb1

，

Rb2

、

Rb3

在大鼠的药代动力学研究。药代动力学参数（表

1

）

采用

DAS2.0

软件的非房室模型计算。

血浆浓度随时间的分布如表

2

所示。

Tmax

结果表明，

Rb3

吸收zui快，

Rb1

是zui慢的。静脉注射后的

T1 / 2

表明，三种人参皂甙在体内消除缓慢。

相比之下，

Rb1

的消除是zui快的，而

Rb3

zui慢。口服给药后

Rb1

的

AUC0

–

36 

h

值，大约

比

Rb2

大

10

倍，比

Rb3

大近两倍，这表明在大鼠

Rb1

的吸收比

Rb2

、

Rb3

高得多。生物利

用度为，

Rb1 0.78%

，

Rb2

的

0.08%

，和

Rb3 0.52%

，所有三种人参皂苷，口服吸收差。由于

系统地比较了三种人参皂苷药代动力学特征，

我们推测人参皂苷的药代动力学行为有结构偏

好性。特别是，带己糖和羟基的人参皂甙（

RB1

）比那些在相同的糖基化位点带有戊糖基团

的可以更好的口服吸收。

4.

结论

一种简单，

快速，

敏感的

LC

–

MS / MS

方法被开发为了大鼠血浆中人参皂苷含量的测定，

。

该法已成功应用于在大鼠的

Rb1

，

Rb2

、

Rb3

的药代动力学研究。三种人参皂甙具有较差的

生物利用度。人参皂苷药代动力学行为的结构偏好。