ELISA试剂盒免疫组织化实验代测染实验计划

1．实验计划
① ELISA试剂盒根据课题的内容选用动物，选用配套的Ab。如Ab—I鼠抗人的抗体，与其他种属间无 交叉，则不能用其他 动物，而且Ab-Ⅱ必须是羊抗鼠，若PAP法Ab-Ⅲ必须来源于鼠，否则不能连接成复合物。
② 若要比较染色深浅在对照组与实验组间的差异，在贴片方面贴于同一张载片上，否则无可比性。
③ 选用的试剂可靠，货源充足，随时可取。
2．Ab稀释度 （如系购买的药盒有工作液和原液）
（1）工作液：无须稀释
（2）原液：
① 应参照其提供的工作液浓度进行预试验验。
如：工作液浓度为1∶1000， 可选1∶500，1∶1000，1∶1500试验；
若: 1∶500有背景，1∶1000阳性反应稍浅，可选1∶750进行试验。
② 原液的保存（—20℃）冻存——应选稀度冻存。
③ 若工作浓度大于1∶500则要先将原液稀释十倍，而后分装10μl/瓶→冻存（-20 ℃）于 冰箱备用。
④ 关于Ab保存应参照说明书。
（3）Ab浓度的选择
Ab浓度不可太高或太低，因为Ag-Ab结合需在一定浓度范围内进行，若一方过剩则形成复合物小且少；极 过剩时已形成的复合物亦会解体而呈现假阴性。——并非Ab浓度越高越好。
3．Ab滴片技术
—— 所滴的抗体应与切片上的组织刚好吻合。
[注意] 滴抗体前需把切片上的水弄干，但不能干片。
要领：甩净组织周围的水。
4．PBS洗涤技术
（1）洗涤的目的
① 保证离子浓度和PH值。
② 减少非特异反应（平时Ab不可靠很纯）
（2）方法：洗三次，每次5分钟。
5．Ab孵育技术
（1）必须在湿盒内进行，以防抗体的蒸发和干片。
（2）温度与时间 4℃：过夜；
37℃：2 h or 参考说明书
6．光镜控制显色方法
（1）室内操作：注意温度与时间的关系，室温zui宜5分钟。
（2）染色稍浅亦可拿出，脱水，封片后颜色可加深。
对照组和染色结果的评价
从以下几 个方面综合评价：
1．阳性染色特点
① Ag定位，胞浆、胞核、胞膜、间质具有结构性。（非特异性～细胞与组织无区别）
② 染色强度不同：颜色深浅不一（非特异性染色 弥散性均匀）
2．组织切片制作过程的影响
① 固定不良—非特异性染色，显示不均。
② 边缘干燥—非特异性染色（常见），加抗体时勿干片。
3．ELISA试剂盒人工假象与特异性结果显示不在同一平面上。
阳性对照：
用已知抗原阳性的切片与待检标本同时进行免疫细胞化学染色。对照切片呈阳性结果，标为阳性对照。
阴性对照：
用确证不含已知抗原的标本作对照，应呈阴性结果，称阴性对照。其实这只是阴性对照中的一种，阴性对照 还应包括空白、替代、吸收和抑制实验。
▲ 染色失败的几种原因：
（1）所染的全部切片均为阴性结果，包括阳性 对照在内。全部（－）原因可能：
① 染色未*严格按照操作步骤进行；
② 漏加一种抗体，或抗体失效；
③  底物中所加H2O2 量少或失效；
￥ 复染或脱水剂使用不当
（2）所有切片均呈阳性反应，原因可能是：
① 切片在染色过程中抗体过浓，或干燥了。
② 缓冲液配置中未加氯化钠和PH值不准确，洗涤不*。
③ 使用已变色的呈色底物溶液，或呈色反应时间过长。
④ 抗体温育的时间过长。
⑤ H2O2 浓度过高，呈色速度过快。粘附剂太厚。
（3）所有切片背景过深，原因可能是：
① 未加酶消化处理切片。
② 切片或涂片过厚。
③ 漂洗不够。
④ 底物呈色反应过久。
⑤ 蛋白质封闭不够或所用血清溶血。
⑥ 使用全血清抗体稀释不够。
（4）ELISA试剂盒阳性对照染色良好，检测的阳性标本呈阴性反应。
zui常见的原因是：标本的固定和处理不当。