显微镜的七种观察方式

方式一明视野观察（Bright field, BF）

明视野镜检是大家比较熟悉的一种镜检方式，广泛应用于病理、检验，用于观察被染色的切片，所有显微镜均能完成此功能。

方式二 暗视野观察（Dark field）

暗视野实际是暗场照明。它的特点和明视野不同，不直接观察到照明的光线，而观察到的是被检物体反射或衍射的光线。因此，视场为黑暗的背景，而被检物体则呈现明亮的像。

暗视野的原理是根据光学上的丁道尔现象，微尘在强光直射通过的情况下，人眼不能观察，这是因为强光绕射造成的。若把光线斜射它，由于光的反射，微粒似乎增大了体积，为人眼可见。暗视野观察所需要的特殊附件是暗视野聚光镜。它的特点是不让光束由下至上的通过被检物体，而是将光线改变途径，使其斜射向被检物体，使照明光线不直接进入物镜，利用被检物体表面反射或衍射光形成的明亮图像。暗视野观察的分辨率远高于明视野观察，达0.02-0.004μm。

方式三 相差镜检法（Phase contrast, PH）

在光学显微镜的发展过程中，相差镜检法的发明成功，是近代显微镜技术中的重要成就。我们知道，人眼只能区分光波的波长（颜色）和振幅（亮度）。对于无色透明的生物标本，当光线通过时，波长和振幅变化不大，在明场观察时很难观察到标本。

相差显微镜利用被检物体的光程之差进行镜检，也就是有效的利用光的干涉现象，将人眼不可分辨的相位差变为可分辨的振幅差，即使是无色透明的物质也可成为清晰可见。这大大便利了活体细胞的观察，因此相差镜检法广泛应用于倒置显微镜。

相差显微镜的基本原理是，把透过标本的可见光的光程差变成振幅差，从而提高了各种结构间的对比度，使各种结构变得清晰可见。光线透过标本后发生折射，偏离了原来的光路，同时被延迟了1/4λ（波长），如果再增加或减少1/4λ，则光程差变为1/2λ，两束光合轴后干涉加强，振幅增大或减小，提高反差。在构造上，相差显微镜又不同于普通光学显微镜，具有两个特殊之处：

（1）环形光阑（annular diaphragm）位于光源与聚光器之间，作用是使透过聚光器的光线形成空心光锥，焦聚到标本上。

（2）相位板（annular phaseplate）在物镜中加了涂有氟化镁的相位板，可将直射光或衍射光的相位推迟1/4λ。分为两种：

①A+相板：将直射光推迟1/4λ，两组光波合轴后光波相加，振幅加大，标本结构比周围介质更加明亮，形成亮反差（或称负反差）。

②B+相板：将衍射光推迟1/4λ，两组光波合轴后光波相减，振幅变小，形成暗反差（或称正反差），结构比周围介质更暗。

方式四 微分干涉镜检术（DIC）

微分干涉镜检术出现于60 年代，它不仅能观察无色透明的物体，而且图像呈现出浮雕状的立体感，并具有相衬镜检术所不能达到的某些优点，观察效果更为逼真。

原理：微分干涉镜检术是利用特制的渥拉斯顿棱镜来分解光束。分裂出来的光束的振动方向相互垂直且强度相等，光束分别在距离很近的两点上通过被检物体，在相位上略有差别。由于两光束的裂距极小，而不出现重影现象，使图像呈现出立体的三维感觉。

DIC 显微镜的物理原理*不同于相差显微镜，技术设计要复杂得多。DIC 利用的是偏振光，有四个特殊的光学组件：偏振器（polarizer）、DIC 棱镜、DIC 滑行器和检偏器（analyzer）。偏振器直接装在聚光系统的前面，使光线发生线性偏振。在聚光器中则安装了偌玛斯基棱镜，即DIC 棱镜，此棱镜可将一束光分解成偏振方向不同的两束光（x 和y），二者成一小夹角。聚光器将两束光调整成与显微镜光轴平行的方向。*初两束光相位一致，在穿过标本相邻的区域后，由于标本的厚度和折射率不同，引起两束光发生了光程差。在物镜的后焦面处安装了第二个偌玛斯基棱镜，即DIC 滑行器，它把两束光波合并成一束。这时两束光的偏振面（x 和y）仍然存在。*后光束穿过第二个偏振装置，即检偏器。在光束形成目镜DIC 影像之前，检偏器与偏光器的方向成直角。检偏器将两束垂直的光波组合成具有相同偏振面的两束光，从而使二者发生干涉。x 和y 波的光程差决定着透光的多少。光程差值为0 时，没有光穿过检偏器；光程差值等于波长一半时，穿过的光达到值。于是在灰色的背景上，标本结构呈现出明暗差。为了使影像的反差达到*佳状态，可通过调节DIC 滑行器的纵行微调来改变光程差，光程差可改变影像的亮度。调节DIC 滑行器可使标本的细微结构呈现出正或负的投影形象，通常是一侧亮，而另一侧暗，这便造成了标本的人为三维立体感，类似大理石上的浮雕。

方式五 偏光显微镜（Polarizing Microscopy, POL）

偏光显微镜是用于研究所谓透明与不透明各向异性材料的一种显微镜。凡具有双折射的物质，在偏光显微镜下就能分辨清楚，当然这些物质也可用染色法来进行观察，但有些则不可能，而必须利用偏光显微镜。

（1）偏光显微镜的特点

将普通光改变为偏振光进行镜检的方法，以鉴别某一物质是单折射（各向同性）或双折射性（各向异性）。双折射性是晶体的基本特性。因此，偏光显微镜被广泛的应用在矿物、化学等领域，在生物学和植物学也有应用。

（2）偏光显微镜的基本原理

偏光显微镜的原理比较复杂，在此不做过多介绍，偏光显微镜必须具备以下附件：起偏镜，检偏镜，补偿器或相位片，无应力物镜，旋转载物台。

（3）偏光镜检术的方式

①正相镜检（Orthscope）：又称无畸变镜检，其特点是使用低倍物镜，不用伯特兰透镜（BertrandLens），被研究对象可直接用偏振光研究。同时为使照明孔径变小，推开聚光镜的上透镜。正相镜检用于检查物体的双折射性。

②锥光镜检（Conoscope）：又称干涉镜检，研究在偏振光干涉时产生的干涉图样，这种方法用于观察物体的单轴性或双轴性。在该方法中，用强会聚偏振光束照明。

（4）偏光显微镜在装置上的要求

①光源：采用单色光，因为光的速度、折射率和干涉现象由于波长的不同而有差异。一般镜检可使用普通光。

②目镜：要带有十字线的目镜。

③聚光镜：为了取得平行偏光，应使用能推出上透镜的摇出式聚光镜。

④伯特兰透镜：聚光镜光路中的辅助部件，这是把物体所有造成的初级相放大为次级相的辅助透镜。它可保证用目镜来观察在物镜后焦平面中形成的平涉图样。

（5）偏光镜检术的要求

①载物台的中心与光轴同轴。

②起偏镜和检偏镜应处于正交位置。

③制片不宜过薄。

（6）典型应用图例

方式六 霍夫曼调制相衬（HMC）

原理是利用斜射光照射，它将相位梯度转换为光强度变化，这样可以用来观察未经染色的样品和活细胞。这项技术可以视厚样品观察有立体感。罗伯特霍夫曼博士在1975 年发明这项技术。

HMC 照明的一个例子是使用在体外受精实验中，其中光照下几乎透明的卵母细胞是很难看清楚。所以HMC 没有DIC 的效果好。

HMC的系统通常包括一个带狭缝的聚光镜和带狭缝的物镜。聚光镜里还有一个可以旋转的起偏器。根据HMC的原理一些显微镜制造商引进该技术的变种，例如尼康的调制相衬（NAMC），奥林巴斯的浮雕相衬（RC）和徕卡的集成霍夫曼调制相衬（IMC）。

方式七 荧光显微镜（Fluorescence Microscopy, FL）

    荧光镜检术是用短波长的光线照射用荧光素标记过的被检物体，使之受激发后产生长波长的荧光，然后观察。

（1）优势：

①检出能力高（放大作用）

②对细胞的刺激小（可以活体染色）

③能进行多重染色

（2）用途：

①物体构造的观察——荧光素

②荧光的有无、色调比较进行物质判别——抗体荧光等

③发荧光量的测定对物质定性、定量分析。