蛋白质定量分析---金坛市精达仪器制造厂

/Bradford 的dye-binding method 是利用Coomassie brilliant blue G-250 （CBG） 可与蛋白质结合而变色的特性来定量 （Bradford, 1976）；若试样中的蛋白质量较多，则结合到蛋白质而变色的CBG 也多，因而呈色较深。下例是以一组标准蛋白质为对象，制作一条蛋白质量与吸光度的标准校正线。

仪器用具：ELISA光度计 （Dynatech） 可在一分钟内测完一片滴定盘微量滴定盘 （microtiter plate, Nunc F96 Maxisorb 442404）Micro test tubes, 大头针或喷火枪

药品试剂：（a） Buffer A-0（b） BSA标准品 （Bio-Rad, bovine serum albumin, 100 μg/mL）（c） 未知浓度样本 （unknown BSA, 0.8 mL, 由教师调配发给）（d） Dye Reagent （Bio-Rad 500-0006） 先以水稀释四倍备用。 以染料Coomassie brilliant blue G-250 配制的溶液，勿与胶体电泳染色用的CBR-250 混淆，各有其使用上的特色，不要互用。

标准品及样本：

标准品系列：使用小试管准备一组BSA （b） 标准品的系列稀释：

◆ 配制一定要，否则校正直线不会很准确；各种试剂的添加，若自稀往浓取样，则可以不用换吸管头。

未知样本：再以上述unknown BSA （c） 准备两种未知样本：Label 未知样本 （c） Buffer A-0 Final Conc.

一般样本：1） 通常由色析法所收集到的各分划样本，都可以直接进行蛋白质定量分析；但若其中含有某些干扰因子 （如含有Triton），或样本的浓度太浓，都必须将样本稀释后再测。2） 同一样本的若干不同稀释浓度，所测出来的zui终蛋白质浓度会有差异，通常是以稀释度大者较为准确。

方法步骤：

1）   每槽先加好50 μL标准品 （#0, #1 … #5） 或未知样本 （X1, X2），以二重复加入96 孔滴定盘中，如图所示。

微量滴定盘的使用

2） 每槽再加入200 μL Dye-Reagent （d），在全部样本槽加完前，不要中断添加；同时小心避免气泡产生。

3） 轻拍滴定盘一侧，使添加的各成份均匀混合，注意Dye-Reagent 密度较大，很容易沉积在下方而分层。 若还有小气泡，小心以大头针刺破，大量时可用喷火枪火焰烧破。

4） 静置室温10 min.

5） 以ELISA reader测量570 nm （或595 nm） 的吸光值。