关于液相色谱精选问答

1.怎么改变流动相比例来延长保留时间?

问题描述：

做的黄酮苷，用甲醇+乙腈+四氢呋喃+醋酸(1:1:19.4:78.6)溶液做流动相，现在分离效果不理想，想延长保留时间看看怎么样，也就是增大流动相的极性，给点建议，谢谢！PS：用的C18柱。

解答：

用液相色谱，C18柱分离黄酮苷，不是太清楚为什么要选用甲醇+乙腈+四氢呋喃+醋酸这样一种很复杂的流动相体系，难道体积分数78.6%的醋酸是直接用的冰醋酸？这是一种很不可思议的流动相配比。建议直接使用甲醇-水，或是乙腈-水作为流动相，水相中可以适当加点甲酸或是乙酸来得到分离效果。

2.保留时间为什么总在变？

问题描述：

苯甲酸的测定中流动相走了很久，进样以后，保留时间还是变，难道这个项目的柱子这么难平衡么？

解答：

保留时间一直在变，说明系统没有平衡好，可以从多个方面去排查原因。

a.流动相可能是最主要的原因，流动相平衡时间是否充足，管路有没有气泡，流动相中有机相是否蒸发，比例阀工作是否正常？

b.泵有可能存在问题，输液是否正常，压力是否稳定，泵密封垫是否完好，是否有漏点？

c.色谱柱也需要排查，是否恒温，是否有漏液？

3.液相色谱中影响峰扩散的有那些因素？

问题描述：

液相色谱中影响峰扩散的有那些因素？与气相色谱相比，有哪些不同之处？

解答：

气相色谱与液相色谱在速率理论方程上的差异主要是由于气体与液体的性质差异造成的。液体的黏度比气体大约100倍，表面张力大约10000倍，密度大约1000倍；气体还具有高压缩性系数。溶质在液体中的扩散系数要远远小于在气体中，液相在传质过程中对理论塔板高度的影响尤其的大。与气相色谱速率理论方程不同的是，液相色谱增加了固定相孔结构内滞留流动相传质项。

因此我们可以得知主要有以下几个方面会影响色谱峰扩张：

1.涡流扩散

涡流扩散是由于柱填料粒径大小不同及填充不均匀等因素造成的流动相在色谱柱内迁移过程中发生的涡流运动。

2.分子扩散

分子是由于进样后，溶质分子在柱内纵轴上存在浓度梯度，引起浓差扩散而使谱带展宽。由于液体流动相的传质速度较慢，分子扩散项B/u可以忽略不计。

3.传质阻力

溶质分子与固定相、流动相分子间存在相互作用，扩散、分配、转移的过程并不是瞬间达到平衡，实际传质速度是有限的，总是存在超前与滞后现象。这使色谱柱总是在非平衡状态下工作，从而产生峰展宽。

4 流速

一般难以观察到H对应的流速，因为流速降低，H总是降低。当u>uopt时，H随着u升高而升高，传质引起的色谱峰扩张也会更明显。

5 固定相颗粒大小

涡流扩散项A和流动相传质阻力项Cm均与柱填料粒径dp的平方成正比，所以固定相粒径与色谱峰扩张有很大的关系。

6 柱温

色谱柱温直接影响到分子在固定相和流动相中的扩散系数DS和Dm，从而影响分子扩散和传质的速率。柱温升高，DS和Dm升高，分子扩散导致柱效降低；而传质改善又导致柱效升高；因此柱温对色谱峰扩张的影响是矛盾的。

4.液相色谱使用缓冲盐的注意事项

解答：

1、避免使用盐酸盐，盐酸盐对钢质有腐蚀作用。

2、缓冲液要现配现用，往往缓冲液是良好的菌类培养液，隔天或放置长时间实验时会有很多怪现象发生。

3、实验后不可用有机溶剂直接过度，有机溶剂会处使盐类析出，造成液路或色谱柱堵塞，可用95：5的水甲醇冲洗。

4、使用缓冲液要及时掌握pH范围，做到胸中有数。

5、清洗液路和柱子时，有温控可加热到30℃易于冲洗。

6、长时间用缓冲溶液要注意观察接头处有无析出，若有白色盐类析出，可考虑一定周期用10%硝酸冲洗一下液路(拆下柱子，走30ml，再用5倍水冲洗)可以避免液路的堵塞。

7、选择缓冲液要用可靠的试剂，避免不纯的盐类造成不必要的麻烦。

如果流动相中有机溶剂的比例很高是不能用来冲洗缓冲盐的，是洗不出来的。通常C18柱先用5%~10%的甲醇冲洗，是可以把缓冲盐冲洗出来的，然后用纯的有机溶剂来保护柱子。方法是使用与流动相相同浓度不含盐的流动相进行清洗。但就是速度慢一些。用水是为了快速替换，一般在15分钟以内，且用0.8的流速较好。如果用纯水冲，容易造成键合的碳链的流失，用5%~10%甲醇水溶液冲。可以用纯水代替流动相中的缓冲液，有机相不变。这样冲洗柱子比较稳妥。